Dvorana u palači Holy Rood. Kaže da grad ima nerede. Netko mu je bio nepoznat na čelu gomile - mumari, maskirani, plesači sa zvonima, ljudi u crnim kapuljačama - prijetili su, predviđali i nagovarali narod da ne posluša kraljicu. Uljudnica kraljice Riccio potvrđuje da također s vremena na vrijeme promatra kako ljudi željno slušaju ove propovijedi. Stranica dalje govori da su ljudi provalili u kraljičinu kapelu uzvikujući: "Papino gnijezdo!", Da je branik Darnley, kraljičin muž, skočio na oltar i počeo se pretvarati u propovijed, a ljudi su mu odgovorili podrugljivim stihovima. Kraljica Mary Stuart u očaju. Osjeća mržnju ljudi, većina dvorjaka je napustila; pita se kako se njezino kršćanstvo može toliko razlikovati od kršćanstva naroda Škotske. Riccio predlaže da se odmah pripremi dekret kojim se kažnjavaju odgovorni za nerede. Maria diktira njegovu stranicu, stranica pojašnjava hoće li unijeti ime Heinrich Darnley, muža kraljice. Marija oklijeva; ona sumnja da su ga neredi potaknuli - naposljetku, okupljanje je predvodio kraljev odbojnik. Ovdje ju Riccio podsjeća da je kraljica; ona je poput sunca i ima pravo kažnjavati od Boga. Zahtijeva da se odmah pozove dežurni službenik i objavi kraljičin dekret. Douglas ulazi. Maria mu govori da odnese papir kraljevskom kancelaru Mortonu kako bi žigosao. Douglas pregledava dekret i vidi da nema ime kralja. Pita kraljicu o ovome. Riccio je odgovoran za nju. Douglas se gubi. Apelira na kraljicu da ne koristi krvave mjere suzbijanja, nagovještavajući da to vidi kao francuski ili talijanski utjecaj. Ali kraljica ga hladno podsjeća na njezinu moć uklanjanja subjekata neposlušnih njenoj volji. Izbila je svađa između Riccija i Douglasa, Douglas izaziva Riccioa na dvoboj i zaklinje se da će sutra ubiti Mlečana. Kraljica odlazi i odvodi Riccija. Douglas je ostao sam, razmišlja o dvoboju. Morton ulazi. Douglas mu pokazuje dekret. Morton je neodlučan: boji se gnjeva i kralja i kraljice. Bez žigosanja, Morton licitira kralja. Henry je u to vrijeme bio angažiran u razgovoru sa svojim rođakom Nickom, koji ga zadirkuje činjenicom da kraljica ima stvarnu moć u Škotskoj, a Henry je samo njen suprug, da kraljica bira bliske osobe, na primjer, ovaj talijanski harfist Riccio ... U ovom trenutku Morton donosi nesretni dekret. Kralj u bijesu, odluči ubiti Riccija. Kralj Lindsay ulazi na dvor, poziva kralja na lov s tek stečenim sokolom. Morton odgovara da kralj već danas ima okupaciju. Lindsay se voljno pridružuje zavjeri protiv Riccija. Doslovno zabranjuje večeras ubiti Riccioa, jer ga mora sutra ubiti. Tada Henry, iskorištavajući odgodu, šalje žestinu astrologu da otkrije kakvo je mjesto zvijezda za njegove namjere.
Astrolog u svojoj laboratoriji (on je također alkemičar) raspravlja sa samim sobom da iskustvo potvrđuje uzaludnost znanosti, da svrha, volja zvijezda dominira nad čovjekom, odstranjuje dobro i zlo. Ulazi Nick, poškropljuje duhovitošću, astrolog mu nije inferioran u duhovitosti. Nick izvještava da ga je kralj poslao da pita o Ricciovoj sudbini i kaže astrologu da predviđa Ricciovu smrt. Astrolog odgovara da će mu zvijezde reći, a ne ljudi, a zauzvrat predviđa smrt jarca. S tim odlazi. Pojavljuje se stranica kraljice koju uzrokuje astrolog. Page voli svoju ljubavnicu. Astrolog mu kaže da kaže kraljici da će danas umrijeti čovjek kojeg voli. "Kako, Botwell će umrijeti danas?" - uzvikne stranica. Astrolog je zbunjen. Imao je na umu Riccioa i žuri stranicu da ga upozori na ovo. Ostavljen na miru, astrolog se pita - također se iz zvijezda pokazalo da je Botwell nekako mračno povezan s kraljicom - preko Marsa, Saturna ... Botwell ulazi. Iz njegova monologa postaje jasno da se neočekivano našao u kući astrologa. Shvaćajući gdje je stigao, Botwell pita astrologa koliko mu je ostalo za život. Starica odgovori da će tri godine i da će Botwell biti kralj. Botwell izvadi bocu otrova kojom je želio počiniti samoubojstvo, želi je baciti - i oklijeva. Doista, u atmosferi palačinih spletki, svako oružje će vam dobro doći. Odlazi.
Stranica govori kraljici da će Riccio uskoro doći. Kraljica ga veseli - prema njenom mišljenju, on je sam ostao vjeran njoj. "A Botvel?" Stranica pita. "Tko je Botvel?" - zanima kraljica. Iznenađena stranica govori Mariji kako je, dok je plovila, jak vjetar skidao ružu s kraljičine glave, cvijet je pao u vodu. A onda je jedan dvorski dvor - Botvel - uletio u čamac i prestrašeno potjerao veslača da uhvati ružu iz vode. Nakon što je čula priču, Marija šalje stranicu da se moli. Ona priznaje Bogu da nema više snage oduprijeti se svojoj ljubavi prema Botwellu. Kraljica zna da se na dvoru smatra zaljubljenim Ricciom. Ulazi Riccio. Marija izvještava o smrtnoj opasnosti koja mu prijeti i hladno se oprosti od njega pokazujući mu brod koji će ga odvesti u Rim. U očaju Riccio pokušava moliti kraljicu da otkaže odluku o odlasku. Kraljica je nepokolebljiva.
Heinrich, Morton i Lindsay saznali su za Ricciov predstojeći odlazak i užurbano se obvezali da će ga ubiti ili pustiti da jedri. Tada se pojavljuje Douglas i javlja da je Riccio već isplovio. Douglas u očaju, čezne za krvavom osvetom, povrijeđena mu je viteška čast. Odjednom naiđu na stranicu koja donosi kraljici bilježnicu od Riccio - nije otišao i bit će s njom navečer. Urotnici mu oduzimaju bilješku.
Maria je zauzeta vezanjem u svojoj sobi. Riccio, koji je došao, objasnio joj je da ne može otići, jer je ujutro imao dvoboj s Douglasom. Priznaje da mu ne treba život bez njene ljubavi. Zamolio je Mariju da mu da vijenac ruža - posadit će cvijeće na oltar u Rimu ... Henry, Douglas i Dindsay ulaze i ubiju Riccija. Kraljica se onesvijesti. Douglasa pogađa sram i užas - dobrovoljno se povlači u egzil. Henry je zabrinut hoće li ga kraljica mrziti. Lindsay odvodi kralja, šapćući mu o nadolazećem lovu. Kraljica Botwell poziva kraljicu. Marija se osjeti, vidi Botvela i prizna mu svoju ljubav. Udarac je prisiljava da prizna da želi Henryjevu smrt i daje joj bocu otrova rekavši da je to pilula za spavanje. Mary daje kralju ovaj "lijek", ali otrov pije buđon. Međutim, ništa ne može zaustaviti ubojitu spletku - Botwell raznese kuću kralja Henryja. U daljini se čuju rastući krikovi gomile. Krila se s kraljicom.